血浆蛋白有助于改善仔猪肠损伤并降低轮状病毒感染副作用

发布人：管理员 时间：2012-08-08

薛晓洁、熊呈编译，选自营养生化之旅

美国北卡罗莱纳州立大学动物科学学院

 

摘要：轮状病毒会感染绝大多数哺乳动物类新生儿并导致腹泻，资料显示每年有近80万的新生动物死于这种病毒。由于血浆蛋白含有生物活性的功能成分，能够大大提高动物抵抗力如抗病原体等；本实验选取感染轮状病毒的仔猪作为研究对象来评估血浆蛋白对动物肠道影响；采用2乘2的析因设计，配方分为两组：配方一添加血浆蛋白组及配方二添加大豆蛋白组；实验对象分为轮状病毒感染仔猪和健康仔猪，试验旨在于对比两组配方是否可以仔猪肠损伤并抵抗轮状病毒感染。所有感染动物排出的粪便中亦携带轮状病毒；实验表明配方一病毒感染仔猪在感染后前三天生长速度与健康仔猪相同且无痢疾症状；配方二病毒感染仔猪生产速度剧减。病毒感染第三天，肠内绒毛长度与绒毛长度与肠腺深度比会降低；然而此时血浆蛋白可以有效削弱轮状病毒对仔猪小肠的负面影响。相比配方二，配方一组病毒感染的猪体内可以维持更高水平的肠粘膜蛋白且总乳糖酶活性。血浆蛋白所含有的生长因子有助于加快康复速度及病毒结合蛋白，降低小肠的负重。以上数据及其他有关血浆抑制动物痢疾的实验数据表明血浆蛋白粉可以明显改善动物新生儿腹泻症状。

 

关键词：轮状病毒；仔猪；血浆蛋白；小肠健康

 

1、引言

   全世界每年大概有2,500,000婴幼儿死于痢疾，尽管近三十年来死亡率有所下降，但发病率未曾变化。引起严重痢疾的主要原因是轮状病毒，每年此类死亡病例高达600,000至800,000。美国政府每年用于治疗婴幼儿轮状病毒引发疾病的治疗费用远远高出10亿美金，而且轮状病毒在鸟类和哺乳动物群体中也相当普遍，感染模式与人类感染近似。

轮状病毒会感染肠上皮细胞，直接破坏肠内粘膜层。病毒粒子在肠上皮细胞内繁殖，导致感染细胞溶解，肠内绒毛反应迟钝甚至退化。消化不良型痢疾一般表现为凹陷/扁平肠双糖酶和水性腹泻，并伴随有脱水现象。总的来说正常绒毛结构的损失会影响营养摄取，可能会导致发育停滞。

   通常情况下，商业化农场中的断奶仔猪断奶后会经历腹泻，由此导致仔猪生长性能下降、死亡率升高。如果坚持饲喂断奶仔猪血浆蛋白（添加量为2%-5%）可以帮助仔猪克服断奶应激，提高其采食量和生长性能；增强仔猪自身的抗病毒免疫能力。上述发现表明血浆蛋白有助于提高恶劣饲养环境下仔猪的生长健康。

  近期一项报告表明用浓缩牛血清饲喂隐孢子虫病毒感染的牛犊可以有效的降低腹泻量和肠道通透性，从而加快肠道康复；饲喂血浆蛋白的大肠杆菌K88感染仔猪不仅快速的摆脱痢疾干扰，而且肠道炎症也有所减轻。上述两项研究发现促使我们进行新的实验，来评估血浆蛋白是否可以降低轮状病毒带来的仔猪小肠损伤并快速康复。

 

 

2.实验对象及实验方法

2.1.动物保健

  实验过程所涉及的动物均经由美国北卡罗莱纳州立大学审核通过。实验对象分两组，每组5头母猪，在预产期前两天注射12.5mg的PGF2a引产。分娩时直接从产道取出仔猪，然后使用70%的乙醇溶液清洗消毒并置于清洁饲养箱内。仔猪单独圈养（笼长0.5米；宽0.3米；高0.4米），房间温度可调控控制在32°；仔猪通过重力进给系统随意采食，出生后2小时内提供被动免疫，24小时内饲喂初乳；饲喂设备及猪笼每天清洁两次。

 

2.2.试验设计

64头小猪根据不同胎划分，并按照2*2的析因设计分为四组。依照仔猪是否感染轮状病毒把其分至不同的房间，实验组配方一中血浆蛋白蛋白的添加比为15%；对照组配方二即添加大豆蛋白组除乳糖外，不含任何动物源性产品。然而两组配方的能量、蛋白、脂肪、乳房和必需氨基酸等含量接近一致；由于大豆蛋白与血浆蛋白的氨基酸构成不同，因此配方二中加入晶体状氨基酸来补充。饲料与水的掺兑比为150g/L,干物质含量约为12%；配制后低温储存（4℃）。为了降低饲料污染并保证仔猪可以任意采食，每天分为在8：00、13：00、18：00和23：00四个时段供给新鲜饲料。

  四天后，根据实验设计仔猪受到轮状病毒感染（0或107）；将轮状病毒和假性接种物混合溶液20ml使用8F胃管强制饲喂仔猪。注射前6小时不供给仔猪日粮，强制饲喂3小时后再次供给不同日粮直至实验结束。每天由专人观察并记录仔猪粪便情况，0级表明粪便正常、1级表示粪便较稀、2级表示粪便过稀、3级表明严重水泻。每日实验员使用棉签直接擦拭仔猪直肠以鉴定轮状病毒是否脱落。简明地讲，打开动物腹腔将胃肠道从胃食管连接处移至直肠末端；将空肠、回肠与十二指肠分开，将胃、肠系膜从腹腔感染部位移至回盲连接处。大致回肠中部位置，去除两段相邻长度约为3cm和10cm的；为测定乳糖生物活性，称取10cm肠道片段置于10mM的磷酸盐溶液中缓冲；同时选取3cm肠内部分作组织分析（10%福尔马林，70%酒精，5%的酸化剂，15%的水）。

 

2.3.分析方法

将直肠刮取物置于2ml的磷酸盐溶液（10Mm、PH 7.5）并轻微振荡，添加5ml凝聚酶至载玻片上样品（10µl）。4分钟后目测凝聚效果，同样分为四个等级，分别为0无凝集、1微量凝集、2适量凝集、3大量凝集，分别代表轮状病毒脱落的程度。

用作组织分析的肠道片段经处理后用苏木紫和曙红染色，借助计算机辅助形态系统由专人用光镜观察选取的肠内片段形象变化，测定每个样品4组定向绒毛的绒毛长度与肠腺深度。根据Dahlqvist描述的方法来分析肠内乳糖活性，之前Bradford也就黏膜匀浆的蛋白质含量做过相关分析。

 

2.4.统计分析

  利用SAS一般线性模型程序进行数据双向分析，仔猪作为实验对象。该模型主要包括不同蛋白原料、轮状病毒对实验对象的影响及两者的相互作用。

 

3.实验结果

    轮状病毒感染前3天，配方治疗效果及感染副作用对仔猪采食量的影响无差别；从第3天至实验结束，不考虑轮状病毒感染的前提下，配方一组仔猪的采食量要比配方二组高出30%；如果不考虑配方，3-14日感染病毒的仔猪和健康仔猪的采食量相当。然而配方一组病毒感染的猪采食量要远远大于配方二组的感染猪群(表1)。在感染后的前3天，配方二组的感染仔猪平均日增重有所下降，只有配方一组感染仔猪日增重的56%。第3天至14天，不考虑感染情况，配方二组的猪增重远远大于配方一组。

病毒感染前或整个实验期间健康猪均无观察到轮状病毒脱落情况发生，然而感染后24小时，即可观察到仔猪体内轮状病毒脱落；并在感染后4到5天达到最大值。不考虑配方分组，感染仔猪病毒脱落数量相当。

每日观察记录痢疾程度，配方一组感染猪群痢疾分值较高（表二）；感染当天此类猪群严重腹泻，并且痢疾分值至感染第7日居高不下，第5日分值达到最高。整个实验过程中，配方二组感染猪群表现良好，与健康仔猪无差异。感染第8日，配方二组感染猪群恢复正常，第3日，不考虑感染情况配方一组猪群粪便干物质成分要高于配方二组。

   为了评估肠道结构，对感染3日和14日的回肠形态进行观察分析；不考虑配方组，感染3日后感染猪群肠道绒毛高度变低（0.0506vs.0.713±0.042mm,p＜0.002),且绒毛与肠腺深度比也有所下降（3.17vs. 4.49±0.31，p=0.004）；配方一组中猪群的肠道绒毛长（0.674vs.0.544±0.042mm，p=0.03）和绒毛与肠腺深度比（4.32vs.3.34±0.31,p=0.03）都要高于配方一组。感染后3日（p=0.43）猪群的肠腺深度无差异，而且感染后14日肠道绒毛长度、肠腺深度（p=0.43）及绒毛肠腺比（p=0.43）也无差异。

接下来将感染后3日和14日内肠粘膜重量、蛋白含量及回肠乳糖活性具体量化以评估肠道的消化能力（表2）；不考虑配方影响，感染3日内肠粘膜重量及蛋白含量有所下降，同时肠道内乳糖活性也会降低。不考虑感染状况，配方一组中猪群的肠粘膜蛋白含量和乳糖活性相对较高；另外配方一组的感染猪群肠粘膜蛋白含量也高于配方二组。感染14日内尽管配方二组的健康猪群乳糖活性低于另外三组，然而配方组之间对生化情况无太大影响。

 

4.讨论

 

   1999年轮状病毒疫苗研发成功，然而由于它会带来肠套叠症状这种疫苗很快就从市场上撤回。不久后，新疫苗研制成功，能够有效预防轮状病毒腹泻。对上述两种疫苗的功效和安全性能进行实验研究，肠套叠和安慰剂没什么两样。另外经发展中国家的临床试验证实儿童在恶劣条件下接受疫苗也会有相似的反应，原因是这种环境下种种因素会降低疫苗的作用。当前适用于各种轮状病毒引发疾病的疫苗尚未研发出来，科研人员利用仔猪模式一直在进行治疗轮状病毒的新思路。之前曾使用轮状病毒肠炎模式来证实营养不良会延缓康复速度。根据先前的实验结果得知血浆可以提高高病原体发生期仔猪的生长性能，并克服仔猪断奶应激；因此血浆被选作一种新的营养配料，它富含免疫球蛋白，生物活性因子及小肽等功能性蛋白成分，而且该实验可以观察到轮状病毒感染急性期血浆蛋白对肠道损伤的作用，大大提高了仔猪的成活率及生长性能。

  实验中配方二组，即饲喂血浆蛋白的病毒感染猪群，在感染后3日内生长速度远远大于配方一组。前期报告显示血浆蛋白良好的适口性可以大大提高仔猪断奶期间的采食量；最新报告表明血浆蛋白可以通过降低氨基酸的分解代谢来提高配方中蛋白利用率。此次实验为了与血浆蛋白氨基酸构成保持一致，我们在大豆蛋白配方组补充适量晶体氨基酸来平衡。感染后3日内，饲喂血浆蛋白的健康猪群的采食量、增重都远远大于配方一组的健康仔猪。

食用血浆蛋白之后，仔猪肠道和痢疾情况明显好转，血浆蛋白大大降低了轮状病毒对肠道绒毛及肠腺的副作用，并且肠粘膜蛋白含量和肠道总乳糖活性也高出饲喂豆类蛋白的猪群。另外感染大肠杆菌的仔猪饲喂血浆蛋白可以降低对肠内上皮组织损伤程度，因此血浆蛋白不仅仅可以改善病菌感染期间动物肠道的健康状况，亦能保证动物采食量及生长速度。 

 

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